两篇文章告诉你，怎么做ceRNA研究

ceRNA和ceRNA调控网络

细胞中有多种RNA，它们之间也有非常丰富的调控方式，ceRNA调控就是其中一种研究较多的调控方式。ceRNA全称competing endogenous RNA，它不是指某一种RNA，而是指生物体内复杂的转录调控网络中的RNA，主要包括蛋白编码基因mRNA、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、假基因（pseudogenes）等。

ceRNA调控网络全称ceRNA regulation network，是指ceRNA参与的整个调控网络。比如：miRNA可通过抑制目的基因mRNA的翻译，或促进mRNA降解来起到负调控的作用，而另一些RNA，如circRNA，能够像海绵一样吸收、结合miRNA，使其不能发挥负调控的作用，从而促进靶基因的表达。在这个过程中miRNA和circRNA起到拮抗的作用：miRNA水平升高抑制靶基因表达，circRNA水平升高则促进靶基因表达。其中的几个主角：circRNA、miRNA、靶基因mRNA共同构成了ceRNA调控网络。一个靶基因可能被多个miRNA、circRNA/lncRNA同时调控，所以ceRNA调控网络可能非常的庞大。由于ceRNA调控网络通常涉及多种类型的RNA分子，所以可以使用使用全转录组测序、分析多种RNA表达情况、构建共表达分析网络的研究策略。

ceRNA调控机制：circRNA与miRNA的互作

circRNA一般由RNA可变剪接产生，circRNA被发现起到miRNA海绵的作用，作为竞争性内源RNA（ceRNA）结合胞内miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用是其主要的调控方式。联合miRNA测序数据，可帮助研究ceRNA调控机制。

案例1
circRNA+miRNA关联分析探究circMTO1在肝细胞癌中的调控机制

背景：环状RNA（circular RNA，circRNA），也是一种內源非编码RNA，它常起到miRNA海绵的作用，在细胞生长发育，功能代谢和某些病理反应中发挥作用。

circRNA-seq：对7组肝细胞癌（HCC）和癌旁组织样本的circRNA表达量进行分析，筛选得到20个显著差异表达的circRNA，其中6个通过了qPCR验证，circMTO1在HCC组织中为一致性的显著低表达。

   

circRNA靶基因预测及验证：因为环状RNA主要起RNA海绵的作用，通过跟miRNA结合，通过circRNA-miRNA-mRNA的途径来调控基因表达，所以作者接下来分析了跟circMTO1相关的miRNA。
作者通过miRNA预测软件miRanda预测circMTO1的靶标。选择其中20个与HCC相关的miRNA进行circRNA的RIP实验验证，发现只有miR-9在pull down的RNA中出现特异富集，证明miR-9与circMTO1的特异结合与互作。为了证明两者在细胞内结合，作者还使用了FISH证明两者共定位。
   

调控机制：    circRNA    → miRNA   → mRNA
                       circMTO1   →  miR-9    →  p21

miR-9的靶基因P21是肿瘤抑制因子，circMTO1的沉默或者miR-9的过表达都会显著降低P21的表达量和蛋白水平、影响HCC增殖。这是一条典型的circRNA-miRNA-mRNA调控途径：正常组织中，miRNA可抑制P21，而circMTO1通过吸收miR-9使肿瘤抑制因子P21上调，发挥抗肿瘤作用，最终导致HCC增殖抑制；肝癌组织中，由于circMTO1低表达，miR-9可以发挥作用，P21的表达被抑制，促进了HCC增殖和肝癌发生。

参考文献
Han D, Li J, Wang H, et al. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression.[J]. Hepatology, 2017.
        
ceRNA调控机制：lncRNA与miRNA的互作

lncRNA（Long non-coding RNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。lncRNAs作用范围广泛，机制非常复杂，可以与DNA、RNA、蛋白质互作，参与表观、转录、转录后等多个层面的调控，在生命活动中有重要作用。lncRNA可以与miRNA互作，作为ceRNA并吸收miRNA，抑制miRNA的作用，促进mRNA表达。

案例1
lncRNA HCP5吸收miRNA促进甲状腺癌发展

RNA-seq：全转录组测序发现滤泡性甲状腺癌组织中lncRNA HCP5的表达量显著高于正常组织，同时人α-2,6-唾液酸转移酶2（ST6GAL2）的表达量也显著升高。
HCP5和ST6GAL2的过表达能够促进甲状腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及血管形成能力，敲除HCP5和ST6GAL2则能抑制甲状腺癌细胞的这些能力。

寻找与lncRNA互作的下游miRNA：lncRNA和mRNA均有促进甲状腺癌的作用，于是作者向ceRNA调控方向探究，作者使用starBase和microRNA.org数据库发现HCP5和ST6GAL2有共同的潜在靶标miR-22-3p、miR-186-5p和miR-216a-5p。
并通过荧光素酶实验、Ago2蛋白RIP实验、RNA pull down实验等证明这些miRNA分别与HCP5、ST6GAL2的相互作用。敲除这些miRNA可上调ST6GAL2的蛋白表达量。

至此ceRNA调控网络中的关键因子都已确定，调控网络也呼之欲出了：miR-22-3p、miR-186-5p和miR-216a-5p能够靶向抑制ST6GAL2，lncRNA HCP5作为竞争性的内源RNA，能吸收miR-22-3p、miR-186-5p和miR-216a-5p，促进ST6GAL2的表达，从而促进甲状腺癌发生。

参考文献
Liang L, Xu J, Wang M, et al. LncRNA HCP5 promotes follicular thyroid carcinoma progression via miRNAs sponge[J]. Cell Death & Disease, (2018) 9:372

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