上海易色医疗科技有限公司

发布时间：2025-05-16 20:24

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RD-RCA涉及一种新型的核酸滚环扩增方法，即重组依赖的核酸滚环扩增方法（Recombination-Dependent Rolling Circle Amplification，RD-RCA）。

具体来说，重组依赖的核酸滚环扩增方法（RD-RCA）又可以分成两种，分别是：拓扑异构酶介导环化的核酸滚环扩增方法（Topoisomerase-mediated Rolling Circle Amplification，Top-RCA）和位点特异性重组酶介导环化的核酸滚环扩增方法（Site-Specific Recombinase mediated Rolling Circle Amplification，SSR-RCA）。这是因为Top-RCA和SSR-RCA在核酸环化的过程中，都需要进行DNA的切割和重新连接，即都需要进行DNA的重组，所以将Top-RCA和SSR-RCA统称为重组依赖的核酸滚环扩增方法（RD-RCA）。

RD-RCA引入两种新的获得单链环状DNA的方法，而后利用可与该环状DNA结合的引物进行超分支滚环扩增（RCA），最终达到大量扩增核酸的目的。该两种方法分别命名为：Top-RCA和SSR-RCA，统称为RD-RCA。下面分别介绍着两种方法：

方法一：Top-RCA

Top-RCA通过将拓扑异构酶技术引入到DNA的环化过程，具体来说是利用拓扑异构酶同时具有的类似限制性内切酶和连接酶的功能，完成单链DNA的环化，而后对环化的DNA进行RCA扩增。

Top-RCA整体来说可以分成以下四个步骤：第一步，设计4个与靶序列互补的引物，两个为内引物，两个为外引物，其中一个内引物的5’端含有拓扑异构酶特异识别位点；第二步，通过具有链置换功能的DNA聚合酶的作用，产生单链DNA，该单链DNA的5’端含有拓扑异构酶特异识别位点；第三步，由拓扑异构酶介导该单链DNA的环化；第四步，环状单链DNA的滚环扩增。

拓扑异构酶可以是牛痘病毒拓扑异构酶I以及其他一切具有位点特异性识别功能的拓扑异构酶。

下面以牛痘病毒拓扑异构酶I（Vaccinia virus topoisomerase I）为例，说明如下四个关键步骤：引物的设计、单链DNA的产生、拓扑异构酶介导该单链DNA的环化、环状单链DNA的滚环扩增。

第一步：引物的设计：靶序列如果是5’到3’的方向，则从5’到3’分别设计F2,F1,B1,B2共4条引物，其中F2,F1与靶序列相同，而B1,B2与靶序列互补。B1引物的5’端添加有：（1）牛痘病毒拓扑异构酶I特异识别的序列5’-AAGG(G/A）-3’；（2） 5’-AAGG(G/A）-3’序列的5’外侧再添加一段短核苷酸序列（如选择4个碱基）。而F1引物的5’端则含有与B1引物的5’-AAGG(G/A）-3’序列的5’外侧再添加的短核苷酸序列互补的序列（如图1所示）。

第二步：单链DNA的产生：首先，B1引物与靶序列互补，在DNA聚合酶的作用下延伸，而后由于外侧B2引物的延伸，产生初始单链DNA；其次，F1引物与该初始单链DNA结合，在DNA聚合酶的作用下延伸，而后由于外侧F2引物的延伸，产生次级单链DNA。该次级单链DNA具有如下特征：（1）3’端含有牛痘病毒拓扑异构酶I特异识别的序列5’-(C/T）CCTT-3’以及其3’外侧的短核苷酸序列；（2）5’端含有与3’端最外侧序列完全相同的序列（如图1所示）。

第三步：拓扑异构酶介导该单链DNA的环化：上述次级单链DNA在与B1引物结合后，其3’端会产生牛痘病毒拓扑异构酶I特异识别的双链5’-(C/T）CCTT-3’位点，该牛痘病毒拓扑异构酶I可在含有5’-(C/T）CCTT-3’序列的DNA链上切割该单链DNA，然后该单链DNA的5’末端依赖与B1引物5’端互补的序列，与3’端靠近，最后再牛痘病毒拓扑异构酶I的作用下，该单链DNA的5’末端与3’末端共价链接，从而获得环状单链DNA（如图1所示）。

第四步：环状单链DNA的滚环扩增：已经结合在该环状单链DNA的B1引物，在DNA聚合酶的作用下，滚环产生串联的线状互补链，F1引物又可与该串联互补链的多个位点结合，在DNA聚合酶的作用下，进行超分支滚环扩增。该过程又可产生与第二步产物相同的单链DNA，该单链DNA又可环化，该环化单链的DNA，又可进行超分支滚环扩增。如此往复，可大量扩增靶序列（如图1所示）。

方法二：SSR-RCA

SSR-RCA通过将位点特异性重组技术引入到DNA的环化过程，位点特异性重组酶介导的DNA环化过程与拓扑异构酶介导的DNA环化过程非常相似。与Top-RCA不同的是，SSR-RCA在两个内引物(F1引物和B1引物)的5’端都必须带有可被位点特异性重组酶识别的特定位点，在获得次级单链DNA后，由于该单链DNA的两端都含有可被位点特异性重组酶识别的特定位点，该DNA可在位点特异性重组酶的介导下发生环化。其他过程与Top-RCA非常相似，不再赘述。

位点特异性重组酶可以是:（1）Tyr-Recombninase，如Cre、Dre;Flp、KD、B2、B3等；（2）Tyr-Integrase，如λ、HK022、HP1、SSV1等；（3）Ser-Resolvase or Ser-Invertase，如Tn3、γδ、ParA、Gin等；（4）Ser-Integrase，如PhiC31、Bxb1、R4等；（5）其他一切具有位点特异性重组功能的酶。

RD-RCA的优点：

RD-RCA与传统的RCA具有许多优点：（1）无需合成高成本长链Padlock探针；（2）无需另外加入单核苷酸片段作为媒介介导环化；（3）拓扑异构酶的连接速度比普通的连接酶快得多，可以缩短单链DNA环化的时间，从而提高核酸的扩增速度和效率，用于检测靶核酸时可以提高检测的灵敏度。（4）使用不同耐热性的拓扑异构酶或者位点特异重组酶，RD-RCA可以实现在不同温度下的等温扩增，比如25度，37度，60-65度。

附图说明

图1. 拓扑异构酶介导环化的核酸滚环扩增方法（Top-RCA）的示意图。具体分成如下10个步骤：

第1步：B1引物与靶序列的结合；

第2步：B1引物在DNA聚合酶的作用下延伸；

第3步：B2引物在DNA聚合酶的作用下延伸，同时将B1引物延伸的链置换出来，产生初始单链DNA；

第4步：F1引物在DNA聚合酶的作用下延伸;

第5步: F2引物在DNA聚合酶的作用下延伸，同时将F1引物延伸的链置换出来，产生次级单链DNA；

第6步: 次级单链DNA在拓扑异构酶的作用下，发生环化，从而获得环状单链DNA；

第7步: B1引物与环状单链DNA结合，同时在DNA聚合酶的作用下发生滚环扩增；

第8步: 滚环扩增的继续进行；

第9步: 滚环扩增到一定阶段，又会产生与第5步相同的次级单链DNA，该单链DNA再次发生环化以及进行新一轮的滚环扩增；

第10步: 环状单链DNA在B1引物和F1引物以及DNA聚合酶的作用下进行超分支滚环扩增。